骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是一种位于骨髓微环境、具有多向分化潜能的成体干细胞。因其取材方便简单、能在体外大量扩增、可自体移植避免免疫排斥和伦理问题，已成为理想的组织工程种子细胞和基因治疗的靶细胞。文献报道，MSCs移植可用于治疗正己烷中毒导致的周围神经病。BMSCs如应用于组织工程和基因治疗，首先需要解决的问题之一是如何高效、安全地标记BMSCs，进而跟踪其在体内的归巢、分化、存活等系列过程。

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5，6－carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，CFSE)是一种可穿过细胞膜、与细胞内氨基不可逆结合的荧光染料，因其标记效率高、容易检测、无放射性而逐渐得到广泛应用。本研究将CFSE用于BMSCs的体外标记，并探讨其最佳标记浓度和最佳标记时间，旨在探索建立体外BMSCs的CFSE标记方法，为BMSCs的移植研究提供实验基础。

BMSCs的CFSE标记

荧光显微镜下观察可见，标记CFSE的BMSCs细胞膜、细胞质和细胞核都发出绿色荧光，整个细胞呈绿色，细胞核的荧光强度最高。CFSE标记的BMSCs仍保持良好的细胞形态，呈梭形或多角形。BMSCs标记CFSE后进行Hochest染色，以计算CFSE标记率，结果显示：CFSE浓度为2．5μmol/L、标记时间为20min及以上时，标记率基本为%；5μmol/L或10μmol/L的CFSE标记15min，细胞标记率即基本为%；CFSE浓度为20μmol/L时，仅标记5min就能使细胞几乎%标记；CFSE浓度＞10μmol/L，作用时间＞15min时，CFSE的浓度和作用时间对标记率无明显影响(P＞0．05)。

CFSE标记对BMSCs存活率的影响10μmol/LCFSE标记BMSCs的时间≤15min时，BMSCs的存活率基本不受影响，但当标记时间为20min或30min时，BMSCs的存活率显著下降(P＜0．05)，仅分别为92．67%和70．33%。不同浓度CFSE标记对BMSCs存活率的影响结果显示，2．5、5、10μmol/LCFSE标记BMSCs15min均不影响细胞活性(P＞0．05)，20μmol/LCFSE标记15min使BMSCs的存活率显著下降为87．45%。CFSE是一种可标记活细胞的荧光染料，具有较强的细胞膜通透性。CFSE进入细胞后，其乙酸基团可被细胞内酯酶水解去除，丧失膜通透性，而具有很高的荧光活性，被激发将发生绿色荧光。此时的CFSE能与细胞骨架蛋白形成可激发荧光的蛋白复合物，该复合物不能脱离细胞，且不会污染邻近细胞，使非标记细胞免受染料影响。

本实验证明，CFSE标记BMSCs的细胞膜、细胞核及细胞质都带有绿色荧光，且标记细胞的形态不受影响。台盼蓝结果显示，CFSE浓度＜20μmol/L、标记时间＜20min时，BMSCs的存活率均未受影响。Dumitriu等报道，CFSE标记细胞后不会引起细胞的凋亡或坏死，而且细胞凋亡坏死后，标记的CFSE仍能稳定地留存于细胞中且不影响凋亡和坏死的发生，以上结果同时证明CFSE标记不影响细胞的生命活动。但当CFSE标记浓度达到20μmol/L或标记时间＞20min时，BMSCs的存活率将会降低，甚至部分细胞出现死亡。故在CFSE对BMSCs标记率都达到%的前提下，本研究选择CFSE较低的作用浓度和较短的作用时间，即10μmol/LCFSE标记15min，作为CFSE标记BMSCs的最佳条件，以在达到CFSE最佳标记效果的同时保持最佳的细胞活性。

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